無(wú)菌隔離器滅菌方法

　　1、菌懸液的制備

　?、偃〗瘘S色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制備成每1ml含菌數小于100cfu的菌懸液15ml；菌懸液平均分裝于3小藍蓋瓶?jì)?，瓶口密?包裝形式與無(wú)菌檢查供試品一致)，2～8℃冰箱存放，24h內備用。

　?、谌“咨钪榫男迈r培養物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制備成每1ml含菌數小于100cfu的菌懸液15ml。菌懸液同金黃色葡萄球菌菌懸液同法分裝及保存。

　?、廴『谇沟男迈r培養物加入3～5ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后取孢子懸液至無(wú)菌試管，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數小于100cfu的孢子懸液15ml。菌懸液同金黃色葡萄球菌菌懸液同法分裝，2～8℃冰箱存放，2月內備用。

　　2、無(wú)菌隔離器的準備

　　以無(wú)菌隔離器裝載量的要求將無(wú)菌檢查所需物品擺放到無(wú)菌隔離器內部相對應的位置；無(wú)菌隔離手套及艙體密封性測試合格；運行參數已確認。

　　3、過(guò)氧化氫氣體濃度及分布狀態(tài)確認

　　取19支過(guò)氧化氫蒸汽化學(xué)指示劑編號，放入無(wú)菌隔離器的手套部位、進(jìn)出風(fēng)口、風(fēng)扇背部、艙體上下四角及垃圾桶底部，滅菌完成后觀(guān)察變se情況。

　　4、BI挑戰實(shí)驗

　　取13支過(guò)氧化氫滅菌生物指示劑(嗜熱脂肪芽孢菌片)分布于無(wú)菌隔離器的8個(gè)手套部位、左右艙門(mén)、艙體操作臺面的左右及垃圾桶底部，滅菌完成后菌片取出接種于胰酪大豆胨液體培養基中，56℃培養，培養7天，觀(guān)察培養物的生長(cháng)情況，同時(shí)取未經(jīng)滅菌的生物指示劑3片同法接種，作為陽(yáng)性對照。

　　5、無(wú)菌隔離器開(kāi)啟滅菌

　　開(kāi)啟無(wú)菌隔離器的自動(dòng)運行程序，依次按照“自動(dòng)除濕”、“自動(dòng)調節”、“自動(dòng)滅菌”、“自動(dòng)通風(fēng)”、“自動(dòng)保壓”五個(gè)階段完成運行程序。

　　6、沉降菌檢測

　　取胰酪大豆胨瓊脂平皿培養基15個(gè)，擺放在隔離器艙體操作臺面上，臺面兩側各放置6個(gè)平皿，臺面左右兩側各放置1個(gè)平皿，垃圾桶底部放置1個(gè)平皿。平皿暴露采樣4小時(shí)，同時(shí)取3只培養基作空白對照，采集完的培養基及空白對照培養基置于20～25℃培養箱中培養72小時(shí)后，再轉入30～35℃培養箱中培養48小時(shí)，記錄培養皿中菌落數量。

　　7、浮游菌檢測

　　取樣點(diǎn)為隔離器操作平臺的左右各1個(gè)點(diǎn)，使用胰酪大豆胨瓊脂平皿，在取樣點(diǎn)工作區附近放置取樣器，進(jìn)行空氣取樣，各取樣點(diǎn)的取樣量為1000升，同時(shí)取3只培養基作空白對照，采集完的培養基及空白對照培養基置于20～25℃培養箱中培養72小時(shí)后，再轉入30～35℃培養箱中培養48小時(shí)，記錄培養皿中菌落數量。

　　8、表面微生物的檢測

　　取胰酪大豆胨瓊脂接觸碟培養基6個(gè)分別對隔離器艙體內表面的上部、下部、左部、右部、前部、后部進(jìn)行接觸10秒采樣；取胰酪大豆胨瓊脂接品平皿培養基(TSA)分別對8個(gè)手套指模進(jìn)行取樣，同時(shí)取3只培養基作空白對照，采集完的培養基及空白對照培養基置于20～25℃培養箱中培養72小時(shí)后，再轉入30～35℃培養箱中培養48小時(shí)，記錄培養皿中菌落數量。

　　9、選擇性微生物挑戰試驗

　?、僭囼灲M一：選擇性微生物菌懸液，小瓶密閉分裝后經(jīng)無(wú)菌隔離器過(guò)氧化氫蒸汽滅菌，接種計數。取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌菌懸液各1ml接種于TSA上，平行接種兩次，30～35℃培養48～72小時(shí)，菌落計數，取平均值；取白色念珠菌、黑曲霉菌懸液1ml接種至沙氏葡萄瓊脂培養基上，平行接種兩次，30～35℃培養3～5天，菌落計數，取平均值。

　?、谠囼灲M二：選擇性微生物菌懸液，小瓶密閉分裝后經(jīng)無(wú)菌隔離器過(guò)氧化氫蒸汽滅菌，并在滅菌完成后拆開(kāi)菌懸液瓶口，使內容物在無(wú)菌隔離器內暴露5min，然后同試驗組一同法接種計數。

　　陽(yáng)性對照組：取保存在冰箱內同批制造的選擇性微生物菌懸液，同試驗組一同法接種數。

　　陰性對照組：另取0.9%無(wú)菌氯化鈉同法接種于TSA及沙氏葡萄瓊脂培養基上，作為陰性對照組。無(wú)菌隔離器