實(shí)驗醫學(xué)微生物學(xué)常用的器材一般包括玻璃器材、金屬器械、橡膠制品及塑料制品等，每類(lèi)器材的處理及消毒措施都有不同。嚴格的消毒滅菌工作極為重要，直接影響著(zhù)整個(gè)實(shí)驗能否順利進(jìn)行。1、消毒滅菌方法

1.干熱滅菌法

是利用恒溫干燥箱內120℃～150℃的高熱，并保持90～120分鐘，殺死細菌和芽孢，達到滅菌目的的一種方法。主要適用于不便在壓力蒸汽滅菌器中進(jìn)行滅菌，且不易被高溫損壞的玻璃器皿、金屬器械以及不能和蒸汽接觸的物品的滅菌。用此方法滅菌的物品干燥，易于貯存。酒精燈火焰燒灼滅菌法也是屬于干熱滅菌的方法之一，在進(jìn)行動(dòng)物細胞體外培養工作時(shí)，常須利用工作臺面上的酒精燈火焰對金屬器具及玻璃器皿口緣進(jìn)行補充滅菌。

2.濕熱滅菌法

壓力蒸汽濕熱滅菌法它利用高壓蒸汽以及在蒸汽環(huán)境中存在的潛熱作用和良好的穿透力，使菌體蛋白質(zhì)凝固變性而使微生物死亡。適合于布類(lèi)工作衣、各種器皿、金屬器械、膠塞、蒸餾水、棉塞、紙和某些培養液的滅菌。高壓蒸汽滅菌器的蒸汽壓力一般調整為1.0～1.1 kg/cm2，維持20～30min即可達到滅菌效果。

3.射線(xiàn)滅菌法

利用紫外線(xiàn)燈進(jìn)行照射滅菌的方法。紫外線(xiàn)是一種低能量的電磁輻射，可以殺滅多種微生物。紫外線(xiàn)的作用機制是通過(guò)對微生物的核酸及蛋白質(zhì)等的破壞作用而使其滅活。適合于實(shí)驗室空氣、地面、操作臺面滅菌。滅菌時(shí)間為30min。用紫外線(xiàn)殺菌時(shí)應注意，不能邊照射邊進(jìn)行實(shí)驗操作，因為紫外線(xiàn)不僅對人體皮膚有傷害，而且對培養物及一些試劑等也會(huì )產(chǎn)生不良影響。

4.過(guò)濾除菌法

是將液體或氣體通過(guò)有微孔的濾膜過(guò)濾，使大于濾膜孔徑的細菌等微生物顆粒阻留，從而達到除菌的方法。過(guò)濾除菌法大多用于遇熱易發(fā)生分解、變性而失效的試劑、酶液、血清、培養液等。

目前，常用微孔濾膜金屬濾器或塑料濾器正壓過(guò)濾除菌，或用玻璃細菌濾器、濾球負壓過(guò)濾除菌。濾膜孔徑應在0.22～0.45μm范圍內或用更小的細菌濾膜，溶液通過(guò)濾膜后，細菌和孢子等因大于濾膜孔徑而被阻，并利用濾膜的吸附作用，阻制小于濾膜孔徑的細菌透過(guò)。

5.化學(xué)消毒劑消毒法

用于那些不能利用物理方法進(jìn)行滅菌的物品、空氣、工作面、操作者皮膚、某些實(shí)驗器皿等。常用的化學(xué)消毒劑包括甲醛、高錳酸鉀、70%～75%乙醇、過(guò)氧乙酸、來(lái)蘇爾水、0.1%新潔爾滅、環(huán)氧乙烷、碘伏或碘酊等。其中利用70%～75%乙醇、10%次氯酸鈉、等進(jìn)行實(shí)驗材料的滅菌;利用甲醛加高錳酸鉀[(2mL甲醛+1g高錳酸鉀)/m3]或乙二醇(6mL/m3)等加熱熏蒸法進(jìn)行無(wú)菌室和培養室的消毒。在使用時(shí)應注意安全，特別是用在皮膚或實(shí)驗材料上的消毒劑，須選用合適的藥劑種類(lèi)、濃度和處理時(shí)間，才能達到安全和滅菌的目的。

6.抗生素抑菌法

主要用于培養液，是培養過(guò)程中預防微生物污染的重要手段以及作為微生物污染不嚴重時(shí)的“急救”措施。常用的抗生素有青霉素、鏈霉素和新霉素等。 

2. 不同 種類(lèi) 物品及培養物的消毒滅菌方法

1.無(wú)菌操作室滅菌

      培養材料進(jìn)行培養、觀(guān)察或更換培養液時(shí)，必須從各方面防止任何污染物進(jìn)入培養液或容器，所以無(wú)菌操作室的滅菌是至關(guān)重要的。由于無(wú)菌操作室的污染來(lái)源主要是空氣中的細菌和真菌孢子，因此長(cháng)期停用后的無(wú)菌操作室應進(jìn)行熏蒸滅菌，熏蒸是用高錳酸鉀+甲醛[(2mL甲醛+1g高錳酸鉀)/m3]進(jìn)行無(wú)菌室的滅菌。經(jīng)常使用的無(wú)菌操作室，在每次使用前都應進(jìn)行地面衛生清潔，并用紫外線(xiàn)燈照射30min，進(jìn)行空氣滅菌。對超凈工作臺，每次操作前用紫外燈照射30min，然后用70%～75%酒精擦拭。

2.培養液滅菌

       培養液在制備過(guò)程中帶有各種雜菌，分裝后應立即滅菌，或在24小時(shí)內完成滅菌工序。目前常用過(guò)濾除菌法除去培養物操作液和培養液中的細菌?；驅ε囵B液中耐熱組進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，然后在無(wú)菌室加入經(jīng)過(guò)過(guò)濾除菌的不耐熱溶液，混勻后分裝備用。

使用高壓蒸汽滅菌器滅菌時(shí)，將分裝好的培養液放入底部有一定量(淹沒(méi)加熱管)涼水的高壓蒸汽滅菌器內，增壓至0.35~0.4 kg/cm2時(shí)排凈滅菌器內冷空氣，以便使蒸汽能到達各個(gè)消毒部位，保證消毒滅菌*。然后繼續加壓加熱，當壓力表讀數達到1.0~1.1 kg/cm2為121℃，保持15~20min即可。由于消毒滅菌效果取決于溫度而不是壓力，所以在一定壓力下保持較長(cháng)的消毒滅菌時(shí)間是必須的。在121℃的蒸汽溫度下可以很快殺死各種細菌及高度耐熱的芽孢桿菌，因此許多培養液的消毒滅菌壓力、溫度一般保持在1.0～1.1 kg/cm2、121℃。消毒滅菌時(shí)間與需要消毒滅菌的培養液量密切相關(guān)(表2-3)，時(shí)間不足達不到滅菌效果，時(shí)間過(guò)長(cháng)培養液內的一些化學(xué)物質(zhì)遭到破壞，影響培養液成分。消毒滅菌結束后，關(guān)閉熱源，只有當滅菌器內壓力降為零時(shí)才能打開(kāi)放氣閥，排除剩余蒸汽，取出培養液。不可在壓力較高時(shí)打開(kāi)放氣閥，引起減壓沸騰，使容器中液體溢出。培養液組成中如含有遇熱易分解的物質(zhì)，則需用過(guò)濾方法消毒滅菌。首先對培養液中耐熱組分進(jìn)行高壓蒸汽滅菌后放置在無(wú)菌場(chǎng)所，固體培養液在40℃左右瓊脂即將凝結前，加入經(jīng)過(guò)過(guò)濾除菌的不耐熱溶液，混勻后冷卻備用。

使用高壓蒸汽滅菌器滅菌時(shí)，將分裝好的培養液放入底部有一定量(淹沒(méi)加熱管)涼水的高壓蒸汽滅菌器內，增壓至0.35~0.4 kg/cm2時(shí)排凈滅菌器內冷空氣，以便使蒸汽能到達各個(gè)消毒部位，保證消毒滅菌*。然后繼續加壓加熱，當壓力表讀數達到1.0~1.1 kg/cm2為121℃，保持15~20min即可。由于消毒滅菌效果取決于溫度而不是壓力，所以在一定壓力下保持較長(cháng)的消毒滅菌時(shí)間是必須的。在121℃的蒸汽溫度下可以很快殺死各種細菌及高度耐熱的芽孢桿菌，因此許多培養液的消毒滅菌壓力、溫度一般保持在1.0~1.1 kg/cm2、121℃。消毒滅菌時(shí)間與需要消毒滅菌的培養液量密切相關(guān)(表2-3)，時(shí)間不足達不到滅菌效果，時(shí)間過(guò)長(cháng)培養液內的一些化學(xué)物質(zhì)遭到破壞，影響培養液成分。消毒滅菌結束后，關(guān)閉熱源，只有當滅菌器內壓力降為零時(shí)才能打開(kāi)放氣閥，排除剩余蒸汽，取出培養液。不可在壓力較高時(shí)打開(kāi)放氣閥，引起減壓沸騰，使容器中液體溢出。培養液組成中如含有遇熱易分解的物質(zhì)，則需用過(guò)濾方法消毒滅菌。首先對培養液中耐熱組分進(jìn)行高壓蒸汽滅菌后放置在無(wú)菌場(chǎng)所，固體培養液在40℃左右瓊脂即將凝結前，加入經(jīng)過(guò)過(guò)濾除菌的不耐熱溶液，混勻后冷卻備用。液體培養液在冷卻到室溫后再加入過(guò)濾除菌溶液。過(guò)濾除菌時(shí)，使用孔徑為0.22～0.45μm或更小的細菌濾膜。過(guò)濾除菌可利用抽濾裝置或注射過(guò)濾器進(jìn)行，所用器皿均應進(jìn)行高壓消毒滅菌，溫度不應超過(guò)121℃。

3.玻璃器皿、塑料器皿和器械滅菌

玻璃器皿可進(jìn)行干熱滅菌或高壓蒸汽滅菌，但在蒸汽滅菌后及時(shí)烘干水分。對不能進(jìn)行高壓蒸汽滅菌的塑料器皿可用75%酒精浸泡，使用前在無(wú)菌操作臺面上晾干的同時(shí)，用紫外線(xiàn)重復殺菌。實(shí)驗室還可以用環(huán)氧乙烷滅菌袋對塑料器皿進(jìn)行消毒，消毒后的器皿要充分散氣2～4小時(shí)后才可使用。無(wú)菌操作所用的各種器械，一般采用干熱或高壓蒸汽滅菌，或用75%酒精浸泡，然后在無(wú)菌操作臺面上晾干的同時(shí)再用紫外線(xiàn)重復殺菌;在使用期間可多次對其進(jìn)行酒精燈火焰灼燒滅菌。

4.培養材料的消毒滅菌

采自動(dòng)物機體的實(shí)驗材料，攜帶著(zhù)微生物及雜質(zhì)，接種前須進(jìn)行表面消毒滅菌，對內部已受微生物侵染的材料應予以淘汰。從動(dòng)物機體采集的某些組織塊，須用消毒劑進(jìn)行浸泡處理，進(jìn)行表面消毒。常用消毒劑有過(guò)氧化氫(10~12%，浸泡5~15 min)、過(guò)氧乙酸(0.05%，浸泡30s~1min)、酒精(70~75%，浸泡2 min)。

3. 滅菌 程序 驗證 內容

撰寫(xiě)驗證方案及制定評估標準。

確認滅菌設備技術(shù)資料齊全、安裝正確，并能處于正常運行。

確認關(guān)鍵設備控制儀表在規定的參數范圍內能正常運行。

采用被滅菌物品或模擬物品進(jìn)行重復實(shí)驗確認滅菌效果符合規定。

完善文件記錄，撰寫(xiě)驗證報告。

4. 滅菌 程序 運行 監控 

關(guān)鍵參數應在驗證確定的范圍內：溫度、壓力、時(shí)間、濕度、滅菌氣體濃度、輻照劑量等

滅菌程序定期驗證，時(shí)效不超過(guò)半年。

滅菌設備或程序發(fā)生變更重新進(jìn)行驗證。

 5.滅菌保證

滅菌冷卻階段防止已滅菌物品再次污染。

適用生物指示劑、化學(xué)指示劑等監控滅菌結果

生物指示劑

基本要求：

菌種的耐受性應大于需滅菌產(chǎn)品中所有可能污染菌的耐受性。

菌種應無(wú)致病性。

菌株應穩定，存活期長(cháng)，易于保存。

易于培養。若使用休眠孢子，孢子含量在90%以上。

 常用生物指示劑

濕熱滅菌：嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子（ATCC7953等，活孢子數為5×105～5×106個(gè)/片)

干熱滅菌：枯草芽孢桿菌孢子（ATCC9372等，活孢子數為5×105～5×106個(gè)/片)

輻射滅菌：短小芽孢桿菌孢子（ATCC27142等，活孢子數為5×107～5×108個(gè)/片)

氣體滅菌：

環(huán)氧乙烷滅菌：

枯草芽孢桿菌孢子（ATCC9372等，活孢子數為5×105～5×106個(gè)/片)

氣態(tài)過(guò)氧化氫滅菌：嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子（ATCC7953等，活孢子數為1×106～5×106個(gè)/片)

過(guò)濾除菌法：缺陷假單胞菌（ATCC19146等）